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東南儀誠談聚丙烯酰胺凝膠(蛋白類)

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳:

1儀器:垂直系列電泳槽;低、中、高壓電源;恒溫循環器

2試劑:丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、考馬斯亮藍硝酸銀、凝膠緩沖液、非變性上樣緩沖液、Tris堿、甘氨酸等

聚丙烯酰胺凝膠電泳

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳1儀器:垂直系列電泳槽;低、中壓電源、恒溫循環器2試劑:丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺,SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液、1.5MTris-HCl(pH8.8)、0.5MTris-HCl(pH6.8)、TEMED、10%(w/v)過硫酸胺溶液、SDS-Page上樣緩沖液:(0.5M Tris(pH6.8)緩沖液、甘油、10%SDS、二硫蘇糖醇、溴酚藍)、Tris、甘氨酸、SDS、考馬斯亮藍硝酸銀等

SDS-Page,在蛋白質裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT

巰基乙醇或DTT可使蛋白質分子中二硫鍵還原,使多肽分成單個亞單位。


PAGE據其有無濃縮效應,分為連續系統與不連續系統

連續系統電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同,帶電顆粒在電場作用下,主要靠電荷及分子篩效應;不連續系統電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續性,帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應,還具有濃縮效應,故分離效果更好。不連續的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質,利用凝膠層的不連續性、緩沖液離子的不連續性、PH的不連續性及電位梯度的不連續性,使樣品在不連續的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區帶,然后進行分離。

樣品濃縮效應

1)凝膠孔徑的不連續性:濃縮膠為大孔膠;分離膠為小孔膠。在電場作用下,樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小,移動速度快;當進入小孔膠時,受到的阻力大,移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處,樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。

2)電位梯度的不連續性:電泳開始后,快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低的低電導區,使局部電位梯度增高,將蛋白質濃縮成狹窄的區帶

緩沖體系離子成分及pH值的不連續性

Tris:緩沖配對離子,維持溶液的電中性及pH值Cl-:在電場中遷移率快,前導離子(leading ion),快離子。Gly:其pI=6.0,在pH6.8的濃縮膠緩沖體系中,甘氨酸解離度很小,因而在電場中遷移很慢,稱為尾隨離子(trailing ion),慢離子。當進入pH8.8的分離膠時,甘氨酸解離度增加,其有效遷移率超過蛋白質;因此Cl-及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續前進。高電勢梯度不存在了,各種蛋白質僅會由于其分子量或構型的不同,在一個均一的電勢梯度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠時所受阻滯的程度不同,表現的泳動率的不同被分開大多數蛋白質在pH6.7或8.3時均帶負電荷,在電場中,都向正極移動。

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